Acides nucléiques

Les dosages (quantitatifs et qualitatifs) des acides nucléiques s’effectuent en routine sur le plateau pour différentes applications et notamment le séquençage NGS.

Le spectrophotomètre Nanodrop 1000 et surtout le fluorimètre Qubit 2.0 pour les vérifications de librairies NGS constituent les appareils de prédilection pour les dosages quantitatifs des acides nucléiques.

Le Bioanalyzer 2100 qui est un système microfluidique d’électrophorèse, est particulièrement requis pour l’estimation de la pureté (pour les ARNs à travers principalement la notion de RIN) et du « sizing » des acides nucléiques.

Ces appareils peuvent être utilisés en mode assisté ou en mode autonome et le Bioanalyzer 2100 fait l’objet d’une réservation en ligne (voir procédure avec les personnels du plateau)

Une Tapestation, d’utilisation plus souple et plus large que le Bioanalyzer 2100, complétera prochainement ces possibilités.

Les séquenceurs de l’UF8843, 3130xl et 3500xlDx basés sur l’analyse d’ADN marqués par fluorescence lors d’une électrophorèse capillaire prennent en charge du séquençage Sanger et de l’analyse de fragments.

séquenceurs 3130xl et 3500xlDx

*Le plateau dispose des 2 technologies de séquençage NGS (deuxième génération) :

Pour la technologie Ion Torrent, un S5 basé sur l’approche séquençage « postlight » offre des possibilités de séquençage de l’ordre de 3 à 80 M de reads pour des longueurs allant suivant le type de puce utilisée de 200pb à 600pb. Ce séquenceur est environné d’un Ion Chef pour prendre en charge la préparation des puces, il peut également être mis à profit pour la création automatisée de librairies de type AmpliSeq.

Pour la technologie Illumina, deux Miseq (de l’UF8843) et un NextSeq 500 offrent différentes possibilités de séquençage avec des capacités allant de 300 Mb à 150 Gb, de 1 M à 400 M de reads et des longueurs jusqu’à 2*300 pb (Miseq).

* De plus le séquençage de troisième génération (NNGS est abordé à travers la technologie Oxford Nanopore sur le séquenceur MinION (UF8843). Celui-ci, à travers l’utilisation de protéines naturelles que sont les Nanopores, permet l’obtention de 10 Gb de données composées de séquences longues (4,5 à 30 kb)  sans biais d’amplification.

Le plateau gère le stockage sécurisé des données sur différents serveurs en fonction du type d’analyse avec un volume total qui se rapproche actuellement des 500 To.

Un travail d’analyse qualitative est délivré à travers l’édition systématique des rapports de runs et l’étude qualité (couverture, profondeur,…).

Applications :

• Whole génome (petits génomes)
• Séquençage ciblé (amplicons, capture)
• Transcriptome
• Exome
• MedIP Seq, ChIP Seq
• Métagénomique

Exemples :

• Caractérisation diagnostique et théragnostique des cancers par séquençage selon la technologie GeneStudio S5 (Ampliseq) et MiSeq (Capture)
• Analyse du transcriptome du pin Douglas
• Caractérisation de variants impliqués dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth(Capture-MiSeq))
• Etude de l’émergence des résistances aux antiviraux en population (séquençages de produits de PCR)
• Recherche d’intégrons comme marqueur de résistance aux antibiotiques dans différents environnements
• Caractérisation de la nature de l’environnement génétique (chromosomique/plasmidique) d’intégrons (MinION)
• Dépistage prénatal non-invasif des trisomies 13, 18 et 21 fœtales (DPNI)
• Variants EBV et pouvoir pathogène